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ATP檢測(cè)方法
三磷酸腺苷(Adenosine Tri-Phosphate, ATP)是自然界各種生命活動(dòng)中共用的能量載體。無(wú)論是真核細(xì)胞還是原核細(xì)胞，都以ATP作為能量?jī)?chǔ)存和轉(zhuǎn)移的分子。ATP可作為細(xì)胞活性的一個(gè)標(biāo)志物。具有代謝活性的細(xì)胞含有一定量的ATP，檢測(cè)ATP含量可作為培養(yǎng)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的定量指標(biāo)；而在細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死時(shí)，其ATP含量會(huì)迅速下降。通過(guò)監(jiān)測(cè)ATP含量的改變，可以評(píng)價(jià)多種藥物、生物制劑或生物活性物質(zhì)引起的細(xì)胞殺傷、細(xì)胞抑制和細(xì)胞增殖作用。ATP也常作為微生物污染的一個(gè)指標(biāo)，微生物繁殖引起食品、藥品等ATP含量的增高，可以被敏感地檢測(cè)到。
ATP檢測(cè)可以用成色反應(yīng)、熒光、化學(xué)發(fā)光或同位素等方法實(shí)現(xiàn)。采用化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)ATP，具有更高的敏感性，并具有簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，因此是目前更為流行的方法?；瘜W(xué)發(fā)光方法檢測(cè)ATP，是基于螢火蟲(chóng)熒光素酶催化熒光素氧化，消耗ATP，發(fā)出光子的高效發(fā)光反應(yīng)；該反應(yīng)的發(fā)光效率極高，發(fā)光量與ATP含量有很好的線性關(guān)系。本公司生產(chǎn)的ATP檢測(cè)試劑盒，應(yīng)用突變重組的螢火蟲(chóng)熒光素酶，催化長(zhǎng)時(shí)發(fā)光反應(yīng)，專門測(cè)定ATP含量。
生物體內(nèi)多種酶促反應(yīng)以ATP為底物，消耗能量；ATP的高能磷酸鍵斷裂，形成ADP或AMP。多種具有重要生物功能的酶如激酶、ATP酶等產(chǎn)生ADP，通過(guò)檢測(cè)其酶促反應(yīng)中ADP與ATP比值，可以間接監(jiān)測(cè)酶促反應(yīng)的進(jìn)程。細(xì)胞在發(fā)生凋亡或壞死時(shí)，其ADP與ATP含量的變化特征不同，檢測(cè)細(xì)胞中ADP與ATP比值，也是區(qū)分細(xì)胞凋亡或壞死的一個(gè)間接指標(biāo)。本公司生產(chǎn)的ATP/ADP檢測(cè)試劑盒，在測(cè)定ATP含量的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將ADP轉(zhuǎn)化為ATP，采用相同的ATP測(cè)定方法，對(duì)ADP含量進(jìn)行定量，從而得到ADP與ATP比值。單個(gè)樣品一體化的測(cè)定方法，給實(shí)驗(yàn)工作帶來(lái)很大的便利。
1. 電泳法：根據(jù)核苷酸分子同時(shí)攜帶酸堿基團(tuán)，在一定條件下，利用其在電場(chǎng)中的遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。
1) 紙電泳法： 將電場(chǎng)加在浸泡過(guò)緩沖液的濾紙上，使ATP與其他雜質(zhì)分離，再利用比色法測(cè)定ATP的吸收值，計(jì)算其含量。此法是衛(wèi)生部及地方采用的ATP標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。
2) 凝膠電泳法：根據(jù)介質(zhì)不同，可分為聚丙烯酰胺電泳法（PAGE），SDS-PAGE和瓊脂糖凝膠電泳法，前兩種方法常用于生物機(jī)制的研究。瓊脂糖凝膠電泳法是以瓊脂糖為介質(zhì)，檸檬酸為緩沖液，利用電泳將ATP與雜質(zhì)分離，實(shí)現(xiàn)ATP含量檢測(cè)。
3) 毛細(xì)管電泳法：以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，利用各組分間淌度和分配行為上的差異，實(shí)現(xiàn)ATP與雜質(zhì)的分離。
2. 光學(xué)分析法：因其操作簡(jiǎn)單、儀器要求低，常用于科研領(lǐng)域的ATP含量分析。
1) 分光光度法：采用ATP試劑盒，因ATP腺嘌呤堿基上存在共軛雙鍵，在紫外下有吸收峰，可用紫外分光光度法檢測(cè)ATP含量。
2) 生物發(fā)光法：利用熒光素在熒光素酶的作用下，與ATP發(fā)生反應(yīng)，生成熒光素-ATP復(fù)合體，該復(fù)合體被分子氧氧化后激發(fā)熒光素發(fā)光，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)弱可檢測(cè)ATP含量。
3. 層析法：利用樣品各組分之間親和力、分配系數(shù)等化學(xué)性質(zhì)的差異，實(shí)現(xiàn)ATP與其它雜質(zhì)的分離。
1) 紙層析法：是檢測(cè)核苷酸含量的常用方法之一。該方法常以異丙醇、濃氨水和水按7：1：2的混合作為展開(kāi)劑。
2) 薄層層析法：該方法紙層析法原理基本相同，也是檢測(cè)核苷酸含量的常用方法之一，其常用的展開(kāi)劑是正丁醇、丙酮、冰乙酸、氨水、水按7：5：3：3：2的比例混合而成。
3) 離子交換色譜法：利用樣品各組分離子交換能力或選擇系數(shù)之間的差異，實(shí)現(xiàn)分離，常用于工業(yè)生產(chǎn)中ATP含量檢測(cè)。
4) 高效液相色譜法：此方法具有強(qiáng)大的分離能力，操作簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，是目前應(yīng)用廣泛的一種ATP檢測(cè)方法
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